NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHỐI U UNG THƯ CỦA VIETLIFE-ANTICAN dạng uống

Nhóm nghiên cứu gồm: PGS.TS. Đỗ Thị Thảo, Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu Khả năng kháng khối u ung thư, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của Vietlife-Antican. Nghiên cứu này được đăng trên tạp chí quốc tế Natural Products Communication.

Phát biểu trong bài phỏng vấn của VTV tại Hội thảo phòng chống Ung thư toàn quốc, tháng 7 năm 2019, Bệnh viện K 3 Tân Triều, PGS. TS. Đỗ Thị Thảo cho biết, phức hệ 3 thành phần Nano thế hệ mới theo công nghệ Solid-Lipid gồm Nano Curcumin từ củ Nghệ vàng, Nano Oleoresin từ củ Gừng, Nano Rutin từ nụ hoa Hòe, có 3 đặc tính nổi trội: 1 là giảm độc tính của hóa chất điều trị Ung thư cụ thể là Cisplatin trên nghiên cứu; 2 là tăng cường hoạt tính kháng U của thuốc điều trị Ung thư; 3 là giúp kéo dài tuổi thọ của đối tượng nghiên cứu so với các nhóm chứng. Đặc biệt, ở liều nghiên cứu 600mg/kg có tác dụng ức chế khối U rõ rệt so với nhóm chứng.

Tóm tắt

Hiện nay, ung thư là căn bệnh gây tỉ lệ tử vong cao, trong khi các liệu pháp điều trị hiện có vẫn còn nhiều hạn chế do những tác dụng phụ độc hại, không mong muốn. Vì vậy các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thu được nhiều quan tâm và nghiên cứu. Antican, một tổ hợp mới từ những thành phần tự nhiên ở dạng cấu trúc nano gồm nanocurcumin, nanorutin và nanooleoresin từ gừng, đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển khối u hiệu quả, kéo dài tuổi thọ, thông qua mô hình gây u trên chuột BALB/c bằng tế bào Lewis Lung Carcinoma (LLC). Bên cạnh đó, Antican cũng được chứng minh sự an toàn khi thử nghiệm khả năng gây độc tính câp (LD₅₀ > 20 g/kg thể trọng) và độc tính bán trường diễn trên chuột. Trong thí nghiệm kháng u, chuột bị u được uống Antican liều 600 mg/kg thể trọng/ngày đã ức chế sự phát triển khối u tới 29,6% so vói đối chứng bệnh lí (P<0,05), kéo dài sự sống tới 34,3 ngày khi so với đối chứng bệnh lý là 28,6 ngày (P<0,05). Kết quả này thực sự có ý nghĩa, cho thấy tiềm năng kháng u hiệu quả của Antican, nên được đưa vào các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo.

Abstract

Nowaday, cancer is at high risk of dead while current therapies have been limited with toxic and unexpected side effects. Therefore, natural products are obtaining much attention from researchers. Antican, a novel combination of nanocurcumin, nanorutin and nano oleoresin from ginger, has been expressed its very promissing antitumor activities and prolong the survial time of tumorized BALB/c mice induced by Lewis Lung Carcinoma (LLC) cells. Besides, Antican showed no toxic effects in acute and subacute toxical tests (LD₅₀ > 20 g/kg b.w.). Additionally, Antican treatment at the dose of 600 mg/kg b.w/day significantly inhibited tumor growth up to  29.6% in comparison with that of the untreated group (P<0,05). The product was also able to significantly extent the survival time of tumorized mice up to 34.3 days while that of the untreated group was 28.6 days (P<0,05). These results are meaningful and present very promising antitumor effects of Antican, which should be considered for further clinical trials.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là căn bệnh gây tỉ lệ tử vong cao chỉ đứng sau bệnh tim mạch. Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong cho khoảng 9,6 triệu ca bệnh trong năm 2018. Các phác đồ điều trị hiện nay có hiệu quả kéo dài tuổi thọ cho người bệnh, tuy nhiên các tác dụng phụ không mong muốn xảy ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống của người bệnh. Bên cạnh đó tổng chi phí hàng năm dành cho bệnh ung thư ngày càng tăng cao. Vì vậy, việc tìm kiếm thử nghiệm các loại thuốc mới an toàn, hiệu quả và giảm giá thành sản phẩm luôn được chú trọng. Với mục tiêu này các hoạt chất từ tự nhiên đặc biệt là hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật được nghiên cứu nhiều nhất. Bên cạnh các hoạt chất từ tự nhiên đã được FDA công nhận và sử dụng trong điều trị bệnh ung thư như Paclitaxel, Vincristine, Homoharringtonine (Seca và Pinto 2018), hàng trăm hoạt chất từ tự nhiên khác đã và đang được nghiên cứu để điều trị bệnh ung thư bao gồm curcumin, rutin… Với khả năng kháng viêm, chống oxy hóa và gây độc với các dòng tế bào ung thư, curcumin cũng như rutin, oleoresin (trong gừng) đã thể hiện tiềm năng kháng ung thư (Bar-Sela và cs, 2010, Hollborn và cs, 2013, Jamil và cs, 2017). Tuy nhiên khả năng hấp thu kém và thải trừ nhanh gây cản trở đến sinh khả dụng của các hoạt chất này. Vì vậy, các cách điều chế mới như nano hóa, tổ hợp hoạt chất vào liposome, hay kết hợp với các hoạt chất khác đang là hướng giải quyết cho vấn đề này. Trong nghiên cứu dưới đây, chúng tôi trình bày kết quả về hoạt tính ức chế khối u phát triển trên mô hình in vivo của chế phẩm Vietlife-Antican với thành phần là Nano Curcumin kết hợp với Nano Rutin và Nano ginger (Gừng).

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Sản phẩm Antican được đóng gói dạng viên nang mềm (750 mg) chứa 50 mg nanocurcumin, 25 mg nanoginger, 0.5 mg nanorutin, được cung cấp bởi công ty Vietlife.

Dòng tế bào và nuôi cấy

Tế bào LLC (Lewis Lung Carcinoma) được nuôi cấy trong môi trường EMEM có chứa 50 µg/mL Gentamicine; 10% huyết thanh phôi bò (FBS)  (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) trong tủ ấm ở nhiệt độ 37^oC, 5% CO₂. Tế bào được cấy chuyển sau 2 ngày.

Phương pháp xác định độc tính cấp trên chuột

70 chuột BALB/c khỏe mạnh có khối lượng 20-24g được chia làm 7 lô khác nhau và bị bỏ đói hoàn toàn 16 giờ trước khi được uống Antican một lần duy nhất với các mức liều khác nhau. Sau khi uống Antican, chuột được theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu và số lượng chết của chuột trong vòng 72 giờ, chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, tiếp tục theo dõi và cân trọng lượng cơ thể chuột trong 7 ngày. Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD₅₀) được tiến hành theo phương pháp của Karber Behrens (Yeo và cs, 2012) như sau: LD₅₀ = LD₁₀₀ – Σa×b/N; Trong đó: LD₁₀₀ là liều thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm; N là số động vật một nhóm; a là sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp; b là tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp.

Phương pháp xác định độc bán trường diễn trên chuột

30 chuột nhắt trắng dòng BALB/c, không phân biệt giống, khối lượng từ 20-24 gram, được chia làm 3 lô (10 chuột/lô) với  lô 1 uống nước cất (0,2 ml/con/ngày) và uống Antican với liều 200 mg/kg/ngày (lô 2); 600 mg/kg/ngày (lô 3) trong 45 ngày liên tục. Trong quá trình thí nghiệm, chuột được theo dõi các biểu hiện bên ngoài như da, lông, mắt, hoạt động thần kinh v.v.  Trọng lượng chuột cũng được theo dõi 10 ngày/lần (thời điểm trước khi uống mẫu gọi là thời điểm ngày 0). Đến ngày thứ 46, thu máu để phân tích một số chỉ tiêu huyết học hóa sinh thể hiện chức năng gan (AST, ALT), thận (creatinin). Chuột cũng được đồng thời mổ kiểm tra trực quan các cơ quan nội tạng gan,thận, lách và so sánh với đối chứng.

Phương pháp gây u trên chuột

60 chuột BALB/c khỏe mạnh, khối lượng từ 25- 30 g, không phân biệt giống, được lựa chọn và tiêm tế bào LLC vào cơ chân sau. Sau 5 ngày, chuột đã gây u được chia ngẫu nhiên thành 3 lô là Lô đối chứng (lô 1) chỉ uống nướ ccất (0,2 ml/con/ngày) và uống Antican với liều 200 mg/kg/ngày (lô 2); 600 mg/kg/ngày (lô 3). Trong quá trình thí nghiệm, thể tích khối u của chuột được xác định thông qua đo chiều dài (a) và chiều rộng khối u (b) bằng thước kẹp mỗi 7 ngày. Thể tích khối u (V) được xác định bằng công thức: V=(a²b)/2. Sau 28 ngày, các mẫu máu của 10 chuột thuộc mỗi lô được thu nhận và xác định một số chỉ số huyết học và hóa sinh (AST, ALT và creatine). Số chuột còn lại thuộc các lô được nuôi tiếp và theo dõi thời gian sống sót.

Phân tích số liệu

Các số liệu được thu thập và phân tích thông qua phép thử Student’s t-test, và one way ANOVA trên phần mềm GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego CA). Số liệu được thể hiện dạng Mean±SE. P<0,05 được xác định là sai khác có ý nghĩa thống kê khi so sánh với đối chứng.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Độc tính cấp và bán trường diễn của Antican

Hiện nay, các liệu pháp điều trị bệnh ung thư như hóa trị liệu hay miễn dịch đã cho kết quả khả quan. Tuy nhiên, độc tính và tác dụng phụ mà bệnh nhân gặp phải khi sử dụng thuốc như thiếu máu, suy nhược, mỏi mệt, gây độc thần kinh ngoại biên v.v ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Việc sử dụng sản phẩm tự nhiên được cho là giải pháp để hạn chế các tác dụng nói trên. Sản phẩm Antican được tổ hợp từ các thành phần có nguồn gốc tự nhiên như curcumin, rutin, ginger nhằm mục đích hỗ trợ điều trị bệnh ung thư vì vậy trước khi kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển của khối u trên mô hình in vivo, Antican được kiểm tra khả năng gây độc cấp tính và bán trường diễn trên chuột nhắt trắng BALB/c.

Kết quả quan sát biểu hiện của chuột trong thời gian 7 ngày từ khi uống Antican, chúng tôi nhận thấy không có chuột chết trong 7 ngày kể cả lô uống Antican liều rất cao 20g/kg thể trọng (LD50> 20 g/kg); không có biểu hiện rối loạn về hoạt động thần kinh, tiêu chảy hay suy nhược; không có sự sai khác về trọng lượng với với đối chứng (Bảng 1). Theo phân loại chất độc theo đường uống của WHO (WorldHealth Organization, 1993), Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế thế giới (Organization for Economic Coorperation and development – OECD) các mẫu thử nghiệm có liều gây chết 50% động vật thực nghiệm LD50 lớn hơn 5g/kg thể trọng theo đường uống thì được coi là không độc. Dựa trên kết quả trên có thể kết luận Antican thuộc nhóm an toàn, không gây độc cấp tính theo đường uống.

Bên cạnh đó, việc bệnh nhân ung thư thường phải sử dụng thuốc điều trị liên tục trong một khoảng thời gian dài, dẫn tới ngộ độc mãn tính cho cơ thể. Các tác dụng không mong muốn hoặc có hại có thể xảy ra, làm suy giảm chức năng hoặc gây tổn thương sinh hóa của các cơ quan trong cơ thể (Walum E, 1998). Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu độc tính bán trường diễn của Antican. Chuột thí nghiệm được uống Antican với các liều 200 và 600 mg/kg trong 45 ngày liên tục nhưng không có các dấu hiệu rối loạn thần kinh, hô hấp hay tiêu hóa. Thông qua trọng lượng chuột (Bảng 2), chúng tôi nhận thấy antican cũng không làm ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể chuột. Chuột ở tất cả các lô thí nghiệm tại thời điểm 45 ngày đều tăng trọng lượng so với thời điểm bắt đầu thí nghiệm nhưng không có sự sai khác thống kê so với đối chứng (P>0,05).

Kết quả ở bảng 3 cũng cho thấy Antican không gây ảnh hưởng đến các chỉ số huyết học (bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu, hemoglobin hay hematocrit) cũng như các chỉ số hóa sinh (AST, ALT hay Creatinin). Sau 45 ngày, động vật ở tất cả các lô được mổ, quan sát trực quan gan, thận, lách. Chúng tôi nhận thấy động vật được uống antican với các liều khác nhau đều có mô gan đồng nhất, không có tổn thương hay hoại tử; thận tương đối đều, không có hiện tượng ứ nước; lách không sưng. Như vậy, Antican khi uống liên tục trong khoảng thời gian dài (45 ngày) đã không thể hiện dấu hiệu gây độc cho động vật thực nghiệm ở cả 2 mức liều nghiên cứu.

2. Khả năng ức chế khối u ung thư của Antican

Khả năng kháng u của Antican được nghiên cứu trên mô hình chuột gây u thực nghiệm bằng tế bào LLC. Kết quả ở hình 1A cho thấy sau khi tiêm LLC, thể tích khối u tăng nhanh, đạt 8005,34 mm³ ở lô đối chứng sau 28 ngày. Tác động của Antican đối với sự phát triển của khối u phụ thuộc vào liều điều trị. Chuột uống Antican liều 200 mg/kg thể trọng/ngày chỉ làm giảm 18,1% sự phát triển của khối u so với đối chứng sau 28 ngày điều trị (P>0,05). Khi chuột được uống Antican liều 600 mg/kg thể trọng thì thể tích khối u giảm 29,6% so với đối chứng bệnh (P<0,05). Bên cạnh đó, Antican thể hiện khả năng kéo dài tuổi thọ của chuột thí nghiệm. Kết quả ở hình 1B cho thấy thời gian sống trung bình của chuột bị gây u sau khi được uống Antican liều 200 mg/kg thể trọng và 600 mg/kg thể trọng lần lượt là 31,8 ngày và 34,3 ngày, cao hơn so với đối chứng bệnh lý (28,6 ngày) và ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Ngoài ra, khi kiểm tra các chỉ tiêu huyết học và sinh hóa máu của chuột gây u được điều trị với Antican, chúng tôi nhận thấy Antican ở cả 2 liều nghiên cứu không làm thay đổi chỉ số huyết học của chuột gây u. Tuy nhiên Antican liều 600 mg/kg thể trọng đã làm giảm đáng kể chỉ số enzyme AST (879,98±30,43 UI/L) khi so sánh với đối chứng và ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,05), cho thấy chế phẩm đã cải thiện hoạt động chức năng gan theo hướng tích cực.

Như vậy, sản phẩm Antican thể hiện khả năng kháng u cũng như kéo dài tuổi thọ trên mô hình chuột được gây u bằng tế bào LLC. Các thành phần của Antican như curcumin, rutin, gừng đã được chứng minh là mang hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và ức chế mạnh sự nhân lên của các dòng tế bào ung thư. Mỗi chất lại ức chế sự phát triển của khối u theo các cách khác nhau như gây apoptosis, điều chỉnh chu trình tế bào, kích thích autophagy, chống di căn v.v. (Bar-Sela, Epelbaumvà cs, 2010, Chen và cs, 2013, Pashaei-Asl và cs, 2017). Vì vậy sự kết hợp của các hoạt chất này cung cấp các con đường khác nhau để ức chế sự phát triển của khối u một cách hiệu quả. Thêm vào đó, các hoạt chất được tổ hợp trong Antican đều ở dạng nano nên đã cải thiện đặc tính sinh khả dụng và không gây độc trên động vật khi uống liều cao cũng như khi uống liều điều trị kéo dài. Các kết quả thu được là rất có ý nghĩa, cho thấy tiềm năng kháng u hiệu quả của sản phẩm Antican.

IV. KẾT LUẬN

Antican, một tổ hợp mới từ những thành phần tự nhiên ở dạng cấu trúc nano gồm nanocurcumin, nanorutin và nanooleoresin từ gừng, đã được chúng tôi chứng minh khả năng ức chế sự phát triển khối u hiệu quả (29,6%),  kéo dài tuổi thọ (34,3 ngày), ở mức có ý nghĩa thống kê trên mô hình gây u trên chuột BALB/c bằng tế bào Lewis Lung Carcinoma (LLC). Bên cạnh đó, Antican cũng được chứng minh sự an toàn khi thử nghiệm khả năng gây độc tính câp (LD₅₀ > 20 g/kg thể trọng) và độc tính bán trường diễn trên chuột. Những kết quả này thực sự có ý nghĩa, cho thấy tiềm năng kháng u hiệu quả của Antican, nên được đưa vào các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bar-Sela G, Epelbaum R and Schaffer M.”Curcumin as an anti-cancer agent: review of the gap between basic and clinical applications.” Curr Med Chem. (2010) 17: 190-197.
2. Chen H, Miao Q, Geng M, Liu J, Hu Y, Tian L, Pan J and Yang Y.”Anti-tumor effect of rutin on human neuroblastoma cell lines through inducing G2/M cell cycle arrest and promoting apoptosis.” TheScientificWorldJournal. (2013) 2013: 269165-269165.
3. Hollborn M, Chen R, Wiedemann P, Reichenbach A, Bringmann A and Kohen L.”Cytotoxic effects of curcumin in human retinal pigment epithelial cells.” PLoS One. (2013) 8: e59603.
4. Jamil Q U A, Jaerapong N, Zehl M, Jarukamjorn K and Jäger W.”Metabolism of Curcumin in Human Breast Cancer Cells: Impact of Sulfation on Cytotoxicity.” Planta Med. (2017) 83: 1028-1034.
5. Pashaei-Asl R, Pashaei-Asl F, Mostafa Gharabaghi P, Khodadadi K, Ebrahimi M, Ebrahimie E and Pashaiasl M.”The Inhibitory Effect of Ginger Extract on Ovarian Cancer Cell Line; Application of Systems Biology.” Advanced pharmaceutical bulletin. (2017) 7: 241-249.
6. Seca A M L and Pinto D C G A.”Plant Secondary Metabolites as Anticancer Agents: Successes in Clinical Trials and Therapeutic Application.” International journal of molecular sciences. (2018) 19: 263.
7. Yeo D, Bouagnon R, Djyh B N, Tuo C and N’guessan J D.”Acute and subacute toxic study of aqueous leaf extract of Combretum molle.” Tropical Journal of Pharmaceutical Research. (2012) 11: 217-223.