Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm CH1701 (VL-Antican gel bôi) trên mô hình bỏng nhiệt

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CHẾ PHẨM CH1701 TRÊN MÔ HÌNH BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM.

Cán bộ tham gia nghiên cứu:

TS. Nguyễn Trần Thị Giáng Hương
Phạm Thị Vân Anh
TS. Trần Thanh Tùng
Ths. Phùng Văn Long
BS. Trần Quỳnh Trang
KTV. Nguyễn Kiều Vân
KTV. Đinh Quang Trường
KTV. Đàm Đình Tranh
KTV. Nguyễn Thành Long

Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội

1. Nguyên liệu, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

1.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu

1.1.1.1. Thuốc nghiên cứu: Chế phẩm CH1701

Ngày gửi mẫu: 9/2017.

Dạng Gel

1.1.1.2.Hoá chất và dụng cụ nghiên cứu:

– Sulfadiazin-bạc (biệt dược Silvadene®) dạng kem bôi 1% sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Trung Ương Huế (Medipharco).

Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu : ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, creatinin và của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máy sinh hóa bán tự động Erba của Ấn Độ.
Các dung dịch xét nghiệm máu của hãng Exigo, định lượng trên máy Exigo – Boule Medical AB của Thụy Điển.
Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.

– Máy scan HP G2410 do công ty Hewlett-Packard của Mỹ sản xuất.

1.1.2. Đối tượng nghiên cứu

– Thử tác dụng trên mô hình bỏng: Chuột cống chủng Wistar, cả hai giống, khoẻ mạnh, cân nặng 180 ± 20g, do Trung tâm cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng – Hà Tây cung cấp.

Động vật được nuôi trong phòng thí nghiệm 7 ngày trước khi nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn dành riêng do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp, uống nước tự do.

1.2. Phương pháp nghiên cứu

1.2.1. Tác dụng của CH1701 trên mô hình gây bỏng nhiệt

Mô hình được tiến hành dựa trên các nghiên cứu trước đó gây bỏng trên da chuột cống trắng. Chuột cống trắng cả hai giống được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 13 con như sau:

Lô 1(Chứng sinh học): Không gây bỏng, không bôi thuốc
Lô 2 (Mô hình): Gây bỏng trên da. Bôi tá dược 2 lần/ngày.
Lô 3 (Chứng dương): Gây bỏng trên da. Bôi sulfadiazin bạc 2 lần/ngày.
Lô 4 (TĐ1 liều thấp – Lô trị 1): Gây bỏng trên da. Bôi CH1701 0,1 ml/1 vết bỏng/1 lần, 2 lần/ngày.
Lô 4 (TĐ1 liều cao – Lô trị 2): Gây bỏng trên da. Bôi CH1701 0,1 ml/1 vết bỏng/1 lần, 4 lần/ngày.

Các thuốc và tá dược được sử dụng ngay sau khi gây mô hình bỏng trên da chuột.

Quy trình:

– Chuột ở các lô được gây tổn thương bỏng trên da theo mô hình gây bỏng nhiệt bằng dụng cụ kim loại theo mô tả của Durmus AS và cộng sự, Vũ Thị Ngọc Thanh [1], [2].

Cạo lông vùng lưng chuột.
Gây mê bằng thiopental liều 50mg/kg chuột theo đường tiêm màng bụng.
Gây bỏng bằng dụng cụ kim loại chuyên biệt để gây bỏng cho chuột, vết bỏng tạo ra có diện tích 2,5cm2, mức độ bỏng độ 2 và 3. Bổ sung ringer lactat cho chuột ngay sau khi gây bỏng với thể tích 1 ml/100g để tránh sốc do mất dịch.
Sau đó ta tiến hành bôi thuốc và bôi tá dược.
Nhốt riêng mỗi chuột 1 chuồng, ăn uống đầy đủ, vệ sinh chuồng sạch sẽ.

Cách thức bôi thuốc:

-Tá dược: Lấy bơm 1ml để lấy tá dược và nhỏ vào vết bỏng với lượng 0,1ml/ 1 vết bỏng sau đó dùng đầu ngón tay trỏ xoa đều 5 lần/1 vết bỏng trong 15 giây, đảm bảo tá dược phủ kín vết bỏng.

-Thuốc: tương tự như bôi tá dược – bôi với 1 lượng 0,1ml/1 vết bỏng/1 lần với cả 2 liều, xoa đều 5 lần/1 vết bỏng trong 15 giây, đảm bảo thuốc phủ kín vết bỏng.

Thời điểm bôi thuốc:

Khoảng cách giữa 2 lần bôi ít nhất 3 giờ (vào các thời điểm: 8h, 11h, 14h và 17h)

Chỉ số nghiên cứu:

Tác dụng điều trị bỏng của CH1701 trên mô hình bỏng:

Tỷ lệ chết của chuột sau khi gây bỏng
Chỉ số hình thái đại thể:

+ Tình trạng tổn thương tại vết bỏng: sưng, nóng, đỏ, phù nề quan sát bằng mắt thường – ghi lại bằng máy ảnh kỹ thuật số. Vết bỏng khỏi lúc bề mặt khô, mép vết bỏng tiến gần nhau, quan sát thấy không còn hiện tượng sưng tấy trên vết bỏng. Chỉ số này được ghi lại theo ngày của từng chuột.

+ Đo diện tích vết bỏng tại các thời điểm 7, 14, 21 ngày sau khi gây bỏng. Tính phần trăm phục hồi theo công thức Walker và Mason [3]: Phần trăm phục hồi = (1 – Ad/Ao) x 100 (trong đó: Ao là diện tích ở ngày 0, Ad là diện tích ở ngày đánh giá). Đo diện tích vết bỏng và xử lý bằng phần mềm ImageJ Basics ver 1.38 đã được Tổ chức y tế Thế giới công nhận là phần mềm để đo đạc diện tích cho các nghiên cứu y sinh học.

Chỉ số hình thái vi thể:

Tại thời điểm 21 ngày, lúc các vết đã bong hết vẩy và đang hồi phục hoặc đã khỏi, chuột được gây mê, lấy mô bệnh học ngẫu nhiên 2 chuột ở mỗi lô tại vị trí trung tâm tổn thương. Đánh giá sự tăng sinh tế bào sợi, tăng sinh mạch máu, tăng sinh sợi collagen, tỷ lệ biểu mô hóa vết thương…

Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thư (do PGS.TS. Lê Đình Roanh đọc kết quả vi thể).

1.2.2. Ảnh hưởng toàn thân của CH1701 trên chuột cống theo đường bôi qua vết bỏng.

Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình nghiên cứu:

Tình trạng chung, thể trọng của chuột
Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu.
Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số chất chuyển hoá trong máu: bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol toàn phần.
Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST.
Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh.

Các thông số theo dõi được kiểm tra khi dùng CH1701 đường bôi sau 3 tuần nghiên cứu.

Mô bệnh học:

Sau 3 tuần uống thuốc, chuột được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan.

Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô.

Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thư (do PGS.TS. Lê Đình Roanh đọc kết quả vi thể).

1.3. Phân tích và xử lý số liệu

Số liệu được xử lý theo thuật toán thống kê y sinh học. Kiểm định sự khác biệt của 2 giá trị trung bình bằng test T student. Các tỷ lệ phần trăm bằng thuật toán c². Kết quả có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

2. Kết quả nghiên cứu

2.1. Tác dụng của CH1701 trên mô hình gây bỏng nhiệt

Tỷ lệ chết của các lô chuột

Thời gian sau khi gây bỏng tỷ lệ chuột chết được ghi lại theo bảng sau:

Theo dõi nghiên cứu cho thấy: chuột chết trong thời gian từ ngày 4 đến ngày 7 sau khi gây bỏng, tỷ lệ chết của lô bôi tá dược là cao nhất (3/13), lô dùng CH1701 liều thấp và liều cao có tỷ lệ chết 2/13, lô dùng sulfadiazin bạc có tỷ lệ chết thấp nhất là 1/13. Tuy nhiên chưa có sự khác biệt rõ rệt.

Diễn biến đại thể tại vết bỏng

Ngay sau khi dùng nhiệt để gây bỏng: vết bỏng có màu trắng ngà, không phồng rộp, có ranh giới rõ với vùng da lành.

Khoảng 1-2 giờ sau, rìa xung quanh vết bỏng nhìn rõ quầng xung huyết.

Các vết bỏng bôi nước cất
Sau 3 ngày 100% các vết bỏng có loét. Vết bỏng ở trong tình trạng hoại tử, trên bề mặt có nhiều ổ loét. Các vết loét rộng dần, chiếm khoảng 45-50% diện tích bề mặt vết bỏng, chứa nhiều dịch tiết có mùi hôi. Vùng xung quanh vết bỏng phù nề, nhưng vẫn có ranh giới với vùng da lành.
Thời điểm 7 ngày: đa số vết loét ở các lô chuột tiết nhiều dịch. Vùng da xung quanh vết bỏng vẫn xung huyết.
Thời điểm 14 ngày: tất cả các vết bỏng đều đã hình thành vảy tiết , vết bỏng bắt đầu bong vảy để lộ vùng tổn thương phía dưới đang phục hồi, các vết bỏng khô. Vùng da xung quanh tổn thương không còn xung huyết.
Thời điểm 21 ngày: tất cả các vết bỏng đã bong vảy, vết bỏng khô, vùng da tổn thương thu hẹp. Riêng ở lô mô hình có một vài vết bỏng vẫn còn ướt.
Tỷ lệ liền khỏi vết bỏng

Vết bỏng khỏi là khi vết bỏng khô, hai mép tiến sát lại gần nhau. Chỉ số này được theo dõi và ghi chép hàng ngày và so sánh giữa các lô. Đánh giá được tiến hành ở ngày thứ 21trước khi làm giải phẫu bệnh, kết quả như sau:

Bảng trên cho thấy: CH1701 ở cả 2 liều và lô bôi sulfadiazin bạc có tác dụng làm tăng tỷ lệ liền khỏi vết bỏng so với lô bôi tá dược có ý nghĩa thông kê (p < 0,05).

Tỷ lệ liền khỏi vết thương ở lô bôi sulfadiazin bạc và CH1701 cả 2 liều là tương đương như nhau (p>0,05).

Mức độ thu hẹp diện tích bỏng:

Từ kết quả trên cho thấy:

Sau 7 ngày dùng thuốc, diện tích bỏng không có sự khác biệt ở tất cả các lô nghiên cứu (p>0,05). CH1701 cả 2 liều có tác dụng làm giảm diện tích bỏng nhanh hơn lô chứng bôi tá dược vào các ngày 14 và 21, sự khác biệt mới có ý nghĩa thống kê (p<0,05).Lô bôi sulfadiazin bạc 1% có tác dụng làm giảm diện tích bỏng nhanh hơn lô chứng bôi tá dược vào các ngày 14 và 21, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Diện tích bỏng của lô bôi CH1701 cả 2 liều so với lô bôi sulfadiazin bạc 1% tương đương nhau ở các thời điểm nghiên cứu (p > 0,05).

Ảnh đại thể diện tích vết bỏng ở các lô chuột sau 7, 14 và 21 ngày như sau:

2.4. Giải phẫu bệnh vi thể da tại vết bỏng

Cấu trúc vi thể da chuột tại vị trí tổn thương bỏng được tiến hành tại thời điểm 21 ngày sau gây bỏng, kết quả được tóm tắt như sau:

NHẬN XÉT

Kết quả nghiên ảnh hưởng toàn thân của CH1701 cho thấy:

Trên cả hai lô chuột, một lô bôi CH1701 liều 0,3ml/vết bỏng/ngày và một lô bôi liều cao gấp 2 lần 0,6ml/vết bỏng/ngày liên tục trong 3 tuần, kết quả cho thấy:

Cả hai liều thuốc thử không làm ảnh hưởng xấu đến tình trạng chung, mức độ tăng trọng lượng của chuột so với lô mô hình (lô bôi nước cất).
Không làm thay đổi kết quả các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu (số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu) so với lô mô hình.
Không làm thay đổi kết quả các xét nghiệm đánh giá chức năng gan (nồng độ bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol toàn phần trong máu chuột) so với lô mô hình.
Không gây hủy hoại tế bào gan (hoạt độ AST, ALT trong máu chuột) so với lô mô hình.
Không làm thay đổi kết quả xét nghiệm creatinin trong máu chuột sau 8 tuần uống thuốc thử liên tục so với lô mô hình.
Không gây tổn thương về mặt hình thái khi quan sát đại thể các cơ quan của chuột so với lô mô hình.
Cấu trúc vi thể gan, thận của chuột: không có tổn thương về cấu trúc vi thể gan, thận chuột sau 3 tuần bôi thuốc so với lô mô hình.

KẾT LUẬN

Mẫu CH1701 gửi đến Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu thử tác dụng trên mô hình bỏng thực nghiệm, kết quả cho thấy:

CH1701 cả 2 liều có xu hướng làm giảm số chuột chết so với lô mô hình (bôi tá dược)
CH1701 cả 2 liều làm nhanh quá trình liền vết thương bỏng thể hiện qua hình thành sẹo sớm.
CH1701 cả 2 liều làm giảm diện tích vết thương bỏng tại thời điểm 14 và 21 ngày so với tá dược.
CH1701 cả 2 liều giảm viêm và tăng sinh xơ trên các xét nghiệm giải phẫu vi thể so với tá dược.
CH1701 liều thấp 0,1 ml/1 vết bỏng/1 lần x 2 lần/ngày tác dụng kém hơn so với TĐ1 liều cao 0,1 ml/1 vết bỏng/1 lần x 4 lần/ngày và CH1701 liều cao có tác dụng tương đương sulfadiazin bạc 1% bôi 2 lần/ngày.
CH1701 cả 2 liều không làm thay đổi về các chỉ số như trọng lượng chuột, chức năng tạo máu, chức năng gan, chức năng thận và không có sự thay đổi về đại thể và vi thể gan, thận so với lô mô hình sau 3 tuần bôi thuốc.

Tài liệu tham khảo

Durmus AS, Han MC, Yaman I (2009). Comperative evaluation of collagenase and silver sulfadiazine on burned wound healing in rats. Firat Universitesi Saglik Bilimleri Veteriner Dergisi, 23, 135 – 139
Vũ Thị Ngọc Thanh (2003), Nghiên cứu độc tính và tác dụng điều trị tại chỗ vết thương bỏng nhiệt của kem chitosan 2% trên thực nghiệm, Luận án tiến sỹ y học, Đại học Y Hà Nội.
Walker HL, Mason AD Jr (1968). A standard animal J Trauma. Nov; 8(6), 1049 – 1051.